微生物學實驗技術:硝化細菌的分離培養(yǎng)
發(fā)布時間：
2022-12-27
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微生物學實驗技術:硝化細菌的分離培養(yǎng)
在污水,污泥或土壤中,有機氮化合物經(jīng)氨化細菌作用,分解成氨,硝化細菌又將氨氧化成硝酸鹽,此過程為硝化作用.它包括兩個連續(xù)的階段:首先,氨經(jīng)亞硝酸細菌作用氧化為亞硝酸；亞硝酸又經(jīng)硝酸細菌作用氧化為硝酸.亞硝酸細菌與硝酸細菌合稱為硝化細菌.它們都為好氧化能自養(yǎng)菌.此外,還有一些異養(yǎng)細菌和放線菌,真菌中的某些種類,也能將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸或硝酸.硝化細菌的分離純化比較困難,主要是因為硝化細菌生長緩慢,而伴生的異養(yǎng)細菌生長迅速.在選擇性較強的硅膠平板上長出的菌落很小,直徑僅有100μm,分離難度很大.
亞硝酸細菌的分離培養(yǎng)
樣品采集
作為亞硝酸細菌的分離源,可采取湖泊中的表層淤泥,溝渠軟泥或城市污水廠的活性污泥.
亞硝酸細菌富集培養(yǎng)基:
(NH4)2S04 2g K2HPO4 1g
MgSO4 7H20 0.5g CaCO35g
FeSO4·7H2O0.4g H2O 1000毫升
NaCl2g pH 7.2
除CaCO3外,其余成分溶解于水中,裝瓶后按0.5%的比例加入CaCO3,121攝氏度,滅菌20分鐘.
若培養(yǎng)硝酸細菌,則以KNO2 2g代替(NH4)2S04.
亞硝酸細菌富集培養(yǎng)
目的是大量淘汰異養(yǎng)細菌,增加亞硝酸細菌的菌數(shù).具體方法如下:
取泥樣0.5至1g,投加于富集培養(yǎng)液中,混勻,置于28攝氏度下培養(yǎng)2至3天后,開始檢測NO2-鹽的生成,通常在7天左右NO2-鹽大量出現(xiàn).
當檢出NO2-鹽后,取0.1毫升富集培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)并檢測NO2-鹽.
經(jīng)7次重復富集培養(yǎng)后,開始連續(xù)供給能源,即每隔3至5天,添加5%硫酸銨溶液2至3毫升,并加入適量碳酸鈣.
硅膠平板培養(yǎng)基的制備
將硅酸鉀或硅酸鈉配制成比重為1.10的溶液,過濾澄清.取比重為1.09的鹽酸,與等體積的上述溶液混合.操作時將硅酸鈉緩慢加入鹽酸內(nèi),攪拌均勻,倒入培養(yǎng)皿內(nèi).每皿20至25毫升,靜置24小時,待凝固成平板后用緩流水沖洗2至3天,以除去氯離子,直至Cl-完全消失.滴加1%硝酸銀溶液測試,如呈白色,表明有Cl-需繼續(xù)沖洗.沖洗后的平板用煮沸的蒸餾水沖洗三次以滅菌.或用紫外線照射滅菌.操作時將培養(yǎng)皿置于距紫外燈2m處,照射30分鐘,皿蓋置于一邊同時滅菌.然后,在每個硅膠平板上加亞硝酸菌富集培養(yǎng)基2毫升和5%(NH4)2S04 溶液1毫升.輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)液分布均勻.打開皿蓋在50攝氏度烘箱內(nèi)烘至平板無水流動為止.
亞硝酸細菌的分離純化
用無菌吸管吸取0.1至0.2毫升富集培養(yǎng)液,接種到上述制成的硅膠平板上.用無菌玻璃推棒將菌液均勻涂布在平板上.置于底部盛水的干燥器內(nèi)(防水分蒸發(fā),免使平板干裂),在28至30攝氏度下培養(yǎng)15至30天.當硅膠平板出現(xiàn)亞硝酸細菌菌落后,挑起菌落再接種到液體培養(yǎng)基中,通過測定NO2-的生成來確定亞硝酸細菌的增殖情況.同時,取少量培養(yǎng)物接種到肉湯蛋白胨培養(yǎng)基中,如觀察到培養(yǎng)液中有異養(yǎng)細菌生長,則必須重復以上的純化分離操作.也可用接種環(huán)挑取富集培養(yǎng)液,點種于硅膠平板分離培養(yǎng)基表面.在皿蓋上放一張濕濾紙或如前法培養(yǎng).由于硅膠平板有高度的選擇性,在點樣周圍的菌落均是亞硝酸細菌.
硝酸細菌的分離培養(yǎng)
取污泥或土壤少量,分別接種于硝酸細菌富集培養(yǎng)液中,混勻,30攝氏度培養(yǎng).在富集培養(yǎng)時要連續(xù)供給5%亞硝酸銨溶液數(shù)毫升,以代替硫酸銨,也有利于抑制其他菌的繁殖.
硝酸細菌的分離純化方法,原則上與亞硝酸細菌相同,可采用硅膠平板法.但在硅膠平板上要加5%亞硝酸銨溶液1毫升以替代硫酸銨溶液,還要投加硝酸細菌培養(yǎng)基2毫升.培養(yǎng)后,在硅膠平板深層形成針頭狀菌落.也可利用硝酸細菌富集培養(yǎng)基中投加1.5至2%瓊脂,制成固體平板,用此平板進行分離純化.
亞硝化菌培養(yǎng)基 (NH4)2SO4 0.5g NaCl 0.3g FeSO4•7H2O 0.03g K2HPO4 1g MgSO4•7H2O 0.03g CaCl2 7.5g 蒸餾水1000毫升 PH 自然固體培養(yǎng)基加5％瓊脂
硝化菌培養(yǎng)基 NaNO2 1g MgSO4•7H2O 0.03g MnSO4•4H2O 0.01g K2HPO4 0.75g Na2CO3 1g NaH2PO4 0.25g 蒸餾水1000毫升 PH 自然固體培養(yǎng)基加5％瓊脂
硝化作用測定
試劑
格利斯試劑溶液Ⅰ:稱取磺胺酸0.5g,溶于150毫升醋酸溶液(30％)中,保存于棕色瓶中. 溶液Ⅱ:稱取α-萘胺0.5g,加入50毫升蒸餾水中,煮沸后,緩緩加入30％的醋酸溶液150毫升中,保存于棕色瓶中.
2%醋酸鈉溶液 將2g無水醋酸鈉加入到100毫升蒸餾水中,混勻溶解.
1.2.4.2 方法
標準曲線的繪制
稱取4.500g分析純亞硝酸鈉于干燥的小燒杯中,加蒸餾水溶解后洗入100毫升容量瓶中,加蒸餾水至刻度定容,搖勻,溶液中NO2-的濃度為30mg/毫升,用時稀釋至NO2-為0.03 mg/毫升.
吸取NO2-標準液(NO2-0.03 mg/毫升)0,1,2,3,4,5 毫升,分別放入50 毫升容量瓶中,每一容量瓶NO2-濃度為0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0μg/毫升；各加入1 毫升格利斯試劑Ⅰ,放置10分鐘,再加入1 毫升格利斯試劑Ⅱ和1毫升2％醋酸鈉溶液,顯色后稀釋至刻度.
用分光光度計于520nm處比色,以濃度為橫坐標,以光密度值為縱坐標繪制標準曲線.
培養(yǎng)液中NO2-測定
亞硝化菌氨轉(zhuǎn)化作用測定 取1 毫升培養(yǎng)液于50 毫升容量瓶中,加入1 毫升格利斯試劑Ⅰ,放置10分鐘,再加入1 毫升格利斯試劑Ⅱ和1毫升2％醋酸鈉溶液,顯色后稀釋至刻度.用分光光度計于520nm處比色.
硝化菌硝化作用強度測定 取1 毫升培養(yǎng)液稀釋100倍(視培養(yǎng)液中NO2-濃度而定),取稀釋后的培養(yǎng)液1 毫升于50 毫升容量瓶中,加入1 毫升格利斯試劑Ⅰ,放置10分鐘,再加入1 毫升格利斯試劑Ⅱ和1毫升2％醋酸鈉溶液,顯色后稀釋至刻度.用分光光度計于520nm處比色.
結(jié)果計算
標準曲線以濃度為橫坐標,以光密度值為縱坐標繪制標準曲線.回歸得到方程y=ax+b ＠亞硝酸根濃度= ,mg/毫升 d=稀釋倍數(shù)
細菌濃度測定
取0.1毫升培養(yǎng)液加到0.9毫升生理鹽水中,混勻,就得到10－1的菌懸液,再取出0.1毫升加到0.9毫升生理鹽水中,得到10－2的菌懸液,同樣方法依次稀釋到10－3,10－4的菌懸液,具體情況視菌懸液濃度而定.
將稀釋好的菌懸液取0.1毫升,與冷卻到50攝氏度的瓊脂培養(yǎng)基混勻,于24攝氏度培養(yǎng)5天,進行計數(shù).