細(xì)菌的生理和生化試驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間：
2022-11-16
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細(xì)菌的生理和生化試驗(yàn)
微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物.因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一,微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)介紹如下:
糖酵解試驗(yàn)
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣.可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn).
試驗(yàn)方法:以無(wú)菌操作,用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許,接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管中,若為半固體培養(yǎng)基,則用接種針作穿刺接種.接種后,置36±1.0攝氏度培養(yǎng),每天觀察結(jié)果,檢視培養(yǎng)基顏色有無(wú)改變產(chǎn)酸,小倒管中有無(wú)氣泡,微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽(yáng)性,若為半固體培養(yǎng)基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無(wú)微小氣泡,有時(shí)還可看出接種菌有無(wú)動(dòng)力,若有動(dòng)力,培養(yǎng)物可呈彌散生長(zhǎng).本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,因而每次試驗(yàn),常需同時(shí)接種多管.一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍(lán)和An-drade指示劑.
淀粉水解試驗(yàn)
某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖.淀粉水解后,遇碘不再變藍(lán)色.
試驗(yàn)方法:以18至24h的純培養(yǎng)物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板一個(gè)平板可分區(qū)接種,試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1攝氏度培養(yǎng)24至48h,或于20培養(yǎng)5天.然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面,若為液體培養(yǎng)物,則加數(shù)滴碘試劑于試管中.立即檢視結(jié)果,陽(yáng)性反應(yīng)淀粉被分解為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化.陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色.
淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程,因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間,培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系.培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適.淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時(shí)制備為妥.
V-P試驗(yàn)
某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中的氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V－P+反應(yīng).
試驗(yàn)方法
O’Meara氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1攝氏度培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液1ml,搖動(dòng)試管1至2分鐘,靜置于室溫或36±1攝氏度恒溫箱,若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅,即判定為陰性.亦有主張?jiān)?8至50攝氏度水浴放置2h后判定結(jié)果者.
Barritt氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1攝氏度培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入a萘酚2-na-phthol純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動(dòng)2至5分鐘,陽(yáng)性菌常立即呈現(xiàn)紅色,若無(wú)紅色出現(xiàn),靜置于室溫或36±1攝氏度恒溫箱,如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性.
快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán),乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動(dòng)后放置5分鐘,判定結(jié)果.不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用.
本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別.在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí),通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生,故應(yīng)省去或以氯化鈉代替.
甲基紅Methyl Red試驗(yàn)
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅.
試驗(yàn)方法:挑取新的待試純培養(yǎng)物少許,接種于通用培養(yǎng)基,培養(yǎng)于36±1攝氏度或30攝氏度以30攝氏度較好3至5天,從第二天起,每日取培養(yǎng)液1ml,加甲基紅指示劑1至2滴,陽(yáng)性呈鮮紅色,弱陽(yáng)性呈淡紅色,陰性為黃色.迄至發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果.
甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4至6.0,其pK值為5.0.故在pH5.0以下,隨酸度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0或上下接近時(shí),可能變色不夠明顯,此時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,重復(fù)試驗(yàn).
靛基質(zhì)Imdole試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚.吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái).吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物.
試驗(yàn)方法:將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,于36±1攝氏度培養(yǎng)24h時(shí)后,取約2ml培養(yǎng)液,加入Kovacs氏試劑2至3滴,輕搖試管,呈紅色為陽(yáng)性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽(yáng)性.
實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng),若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取,再加試劑,則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,因而結(jié)果更為可靠.
硝酸鹽Nitrate還原試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn).
試驗(yàn)方法:臨試前將試劑的A磺胺酸冰醋酸溶液和Bα－萘胺乙醇溶液試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面,立即或于10分鐘內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽(yáng)性,若無(wú)紅色出現(xiàn)則為陰性.
用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),陽(yáng)性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果.進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照.α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意.
明膠Gelatin液化試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有明膠酶亦稱類蛋白水解酶,能將明膠先水解為多肽,又進(jìn)一步水解為氨基酸,失去凝膠性質(zhì)而液化.
試驗(yàn)方法:挑取18至24h待試菌培養(yǎng)物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基.于20至22培養(yǎng)7至14天.明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1.每天觀察結(jié)果,若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化,如確被液化,即為試驗(yàn)陽(yáng)性.平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑,若為陽(yáng)性,10至20分鐘后,菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán).否則為陰性.
尿素酶Urease試驗(yàn)
有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶,將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,酚紅呈粉紅色.尿素酶不是誘導(dǎo)酶,因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?細(xì)菌均能合成此酶.其活性最適pH為7.0.
試驗(yàn)方法:挑取18至24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中,搖均,于36±1培養(yǎng)10,60和120分鐘,分別觀察結(jié)果.或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面,不要到達(dá)底部,留底部作變色對(duì)照.培養(yǎng)2,4和24h分別觀察結(jié)果,如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天,作最終判定,變?yōu)榉奂t色為陽(yáng)性.
九、氧化酶Oxidase試驗(yàn)
氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng).
試驗(yàn)方法:在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1至2滴,陽(yáng)性者Kovacs氏試劑呈粉紅色至深紫色,Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色.陰性者無(wú)顏色改變.應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果.
硫化氫H2S試驗(yàn)
有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產(chǎn)生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物.
試驗(yàn)方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中,沿管壁穿刺接種,于36±1培養(yǎng)24至28h,培養(yǎng)基呈黑色為陽(yáng)性.陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天.也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營(yíng)養(yǎng)肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空,以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1培養(yǎng)1至6天.紙條變黑為陽(yáng)性.
三糖鐵TSI瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1培養(yǎng)18至24h,觀察結(jié)果.
本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣變黃；產(chǎn)生硫化氫變黑.葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故使斜面后來(lái)又變紅,底部由于是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色.
硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力SIM瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法:以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度,置36±1培養(yǎng)18至24h,觀察結(jié)果.培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽(yáng)性,混濁或沿穿刺線向外生長(zhǎng)為有動(dòng)力,然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面,靜置10分鐘,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性.培養(yǎng)基未接種的下部,可作為對(duì)照.